小鼠胚胎操作实验手册(原著第三版)

.2.1.8卵母细胞和合子的细胞骨架组装47
2.1.9早期卵裂：从1细胞胚胎到8细胞未致密化桑葚胚48
2.1.10用rtpcr和cdna文库分析胚胎基因表达50
2.1.11胚胎细胞核的发育潜能51
2.1.12致密化和胚泡形成：最早的分化事件52
2.1.13滋养外胚层和内细胞团细胞系的分离53
2.1.14胚胎植入子宫53
2.1.15滋养外胚层及其衍生物55
2.1.16原始内胚层和外胚层分化：第二轮分化57
2.1.17小鼠胚胎中的细胞系标记分子57
2.1.18原始外胚层细胞系57
2.1.19原肠作用：中胚层和终末内胚层的形成62
2.1.20原肠作用的命运图谱65
2.1.21中胚层中区域多样性的产生68
2.1.22前部脏内胚层68
2.1.23原结68
2.1.24尾芽70
2.1.25胚胎旋转70
2.1.26体节及其衍生物70
2.1.27侧板和间介中胚层以及它们的衍生物74
2.1.28四肢发生76
2.1.29神经化：神经系统的发生77
2.1.30神经管区域多样化的发生78
2.1.31神经嵴79
2.1.32鳃弓和咽区的发生82
2.1.33肠的发育83
2.1.34畸胎瘤细胞和胚胎干细胞83
2.1.35胚胎大小的调节84
2.1.36基因印迹85
2.1.37x染色体失活86
2.1.38胚外组织87
2.1.39胚外内胚层：原始内胚层只形成脏内胚层和壁内胚层88
2.1.40脏内胚层中的基因表达89
2.1.41壁内胚层中的基因表达91
2.1.42胚外中胚层的分化91
2.1.43胎盘的结构与功能91
2.2成年小鼠93
2.2.1小鼠毛色及其遗传学93
2.2.2形态及行为突变98
参考文献98
第3章转基因小鼠和嵌合体小鼠的生产：一般要点119
3.1实验鼠群的病原控制121
3.2提供供体和/或受体小鼠的育种群123
3.3自然交配的安排123
3.4诱导超数排卵124
3.4.1年龄和体重的影响124
3.4.2促性腺激素的剂量125
3.4.3促性腺激素的注射时间125
3.4.4超排小鼠的品系126
3.4.5种公鼠的繁殖性能126
3.5胚胎供体和受体的生产126
3.5.1配种提供dna注射用合子的母鼠126
3.5.2提供制作es细胞嵌合体用囊胚或卵裂期胚胎的母鼠127
3.5.3繁殖力正常的种公鼠128
3.5.4用于诱导母鼠假孕的不育公鼠128
3.5.5用作假孕受体的母鼠129
3.6基因工程小鼠的命名130
3.7实验方案［腹腔内（ip）注射］131
参考文献131
第4章植入前胚胎的收集和体外培养133
4.1着床前胚胎的培养液135
4.1.1研究史135
4.1.2小鼠胚胎的培养液136
4.1.3胚胎培养液的关键成分137
4.1.4最新进展139
4.2体外胚胎培养的一般问题141
4.2.1培养液的准备141
4.2.2胚胎收集和培养142
4.2.3质量控制143
4.3胚胎培养液的准备144
4.4移卵管的组装144
4.5着床前胚胎的收集146
4.6实验方案146
4.6.1方案1配制m16培养液146
4.6.2方案2配制m2培养液147
4.6.3方案3从浓储液制备m2和m16培养液148
4.6.4方案4制备ksom培养液149
4.6.5方案5制备培养微滴150
4.6.6方案6用玻璃毛细管拉制移卵管151
4.6.7方案7玻璃移液管的硅化152
4.6.8方案8打开腹腔并定位雌性生殖器官153
4.6.9方案9收集合子并利用透明质酸酶去掉卵丘细胞153
4.6.10方案10收集2细胞到致密化的桑葚胚阶段的胚胎156
4.6.11方案11囊胚的收集159
参考文献160
第5章植入后胚胎的分离、培养和操纵167
5.1植入后胚胎的分离169
5.1.1早期胚胎着床点的观察169
5.1.2植入后胚胎的分离169
5.1.3胚外膜的剥离169
5.1.4植入后胚胎胚层的分离170
5.1.5胚层的重组和培养170
5.1.6从生殖嵴中分离生殖细胞170
5.2植入后胚胎的培养171
5.2.1胚胎的准备171
5.2.2植入后胚胎的滚筒式培养171
5.2.3植入后胚胎的静态式培养171
5.2.4用于摄取图像的植入后胚胎的静态式培养172
5.3植入后胚胎基因注射的电穿孔技术172
5.4实验方案173
5.4.1方案1通过注射染料观察早期胚胎的着床点173
5.4.2方案2植入后胚胎的分离174
5.4.3方案3胚外膜的剥离177
5.4.4方案4植入后胚胎胚层的分离181
5.4.5方案5胚层的重组与培养183
5.4.6方案6自生殖嵴中分离生殖细胞184
5.4.7方案7植入后胚胎的旋转式培养186
5.4.8方案8植入后胚胎的静态式培养190
5.4.9方案9用于摄取图像的植入后胚胎的静态式培养191
5.4.10方案10电穿孔技术193
参考文献195
第6章外科手术方法197
6.1概论199
6.2输精管及卵巢切除术200
6.3胚胎移植200
6.3.1输卵管内胚胎移植200
6.3.2子宫内胚胎移植200
6.3.3受体雌鼠201
6.3.4胚胎移植的技术要点201
6.4剖腹产手术和子鼠寄养202
6.5组织移植202
6.6活体组织检查202
6.7实验方案202
6.7.1方案1制作不育雄鼠的输精管切除术202
6.7.2方案2诱导胚泡延迟着床的卵巢摘除术205
6.7.3方案3输卵管内胚胎移植206
6.7.4方案4子宫内胚胎移植209
6.7.5方案5剖腹产手术和子鼠寄养211
6.7.6方案6肾囊下组织移植212
6.7.7方案7es细胞的皮下注射214
6.7.8方案8肝脏的部分切除术214
6.7.9方案9脾切除术215
6.7.10方案10肾切除术216
6.7.11方案11去势术216
6.7.12方案12尾动脉采血217
参考文献218
第7章转基因小鼠的制备221
7.1小鼠转基因技术的应用223
7.2原核显微注射法将基因导入小鼠基因组224
7.3转基因的构建225
7.3.1原核载体序列的影响225
7.3.2dna构件的长度226
7.3.3两种或多种转基因的共注射226
7.3.4转基因与内源基因的差异性表达226
7.3.5调控序列的鉴定方法227
7.3.6报告基因227
7.3.7转基因构件中已知组织特异性调控序列的利用227
7.3.8转基因表达过程中cdna的表达以及内含子的作用228
7.3.9利用“管家基因”启动子指导基因的专一性表达228
7.3.10影响基因转移效率的相关因素228
7.3.11大型dna构件相关知识概述229
7.4dna的分离与纯化229
7.4.1概述229
7.4.2dna污染物及其去除方法230
7.4.3推荐使用的商业化质粒制备及dna纯化试剂盒231
7.4.4从细菌培养物中提取标准大小的质粒dna231
7.4.5质粒dna消化获得基因构件片段232
7.4.6凝胶分离232
7.4.7琼脂糖凝胶中dna片段的回收233
7.4.8dna片段的纯化233
7.5显微注射用dna的制备233
7.5.1dna质量的鉴定及其维持233
7.5.2注射用dna浓度的测定234
7.5.3dna溶液需要过滤吗235
7.5.4dna的储存235
7.6操作器械以及合子的准备235
7.6.1小鼠品系的选择235
7.6.2合子的准备235
7.6.3固定针的制作235
7.6.4显微注射针的制作236
7.6.5显微操作设备的安装238
7.7显微注射241
7.7.1原核注射的时间241
7.7.2小鼠合子的显微注射241
7.7.3注射后的胚胎操作241
7.8转基因小鼠品系的建立及其维持242
7.9实验方案242
7.9.1方案1简便可靠的dna分离与纯化方法242
7.9.2方案2利用nucleobond系统从细菌培养物中分离bac dna244
7.9.3方案3nucleobond制备的bac dna的纯化244
7.9.4方案4酵母dna凝胶板的大规模制备245
7.9.5方案5利用过滤法纯化yac dna247
7.9.6方案6标准大小dna的注射缓冲液的配制248
7.9.7方案7bac/yac dna注射缓冲液的配制249
7.9.8方案8固定针的制作249
7.9.9方案9注射针的制作250
7.9.10方案10显微操作步骤251
7.9.11方案11小鼠合子的显微注射253
7.10常见问题排除指南256
参考文献260
第8章囊胚来源的干细胞系的分离和培养269
8.1es细胞系的获得271
8.2es细胞的培养272
8.2.1支原体和小鼠抗体产物的检测272
8.2.2es细胞的培养条件273
8.2.3培养基274
8.2.4血清275
8.2.5白血病抑制因子276
8.2.6胰蛋白酶/edta276
8.3饲养细胞276
8.3.1原代小鼠胚胎成纤维细胞276
8.3.2sto成纤维细胞277
8.4es细胞染色体的计数277
8.5es细胞在体外的分化278
8.6滋胚层干细胞278
8.7实验方案278
8.7.1方案1小鼠胚胎成纤维细胞的制备278
8.7.2方案2由mef或sto细胞制备饲养层细胞280
8.7.3方案3es细胞的传代281
8.7.4方案4用冻存管冷冻和解冻es细胞282
8.7.5方案5用囊胚从头分离es细胞283
8.7.6方案6es细胞染色体的计数288
8.7.7方案7es细胞分化为类胚体290
8.7.8方案8培养ts细胞系290
8.7.9方案9从囊胚分离ts细胞系292
参考文献294
第9章基于胚胎干细胞的转基因和基因组改变的载体设计297
9.1元件总汇299
9.1.1基因组和基因元件299
9.1.2可筛选标记299
9.1.3报告基因301
9.1.4位点特异重组酶301
9.1.5可诱导系统303
9.1.6检测重组酶的报告子303
9.2es细胞介导的转基因303
9.3基因打靶305
9.4基因和启动子诱捕308
9.5同源重组——置换310
9.6位点特异性重组介导的插入311
9.7可诱导位点特异染色体变异313
9.8产生纯合突变的es细胞系314
9.9实验方案（体外筛选以在小鼠中获得普遍性转基因表达）315
参考文献317
第10章向胚胎干细胞中导入外源dna323
10.1一般注意事项325
10.2向es细胞基因组中导入的dna的纯化325
10.3dna导入es细胞的电转化以及筛选方法325
10.4es细胞克隆的挑取、平板传代以及冻存es细胞系用于基因型分析325
10.5用培养于96孔组织培养板中的细胞快速准备dna326
10.6实验方案327
10.6.1方案1通过电转化向es细胞中导入dna以及筛选方法327
10.6.2方案2通过挑取的方法分离单个es细胞克隆329
10.6.3方案3在96孔组织培养板中冻存es细胞330
10.6.4方案4在96孔组织培养板中解冻es细胞331
10.6.5方案5用培养于96孔组织培养板中的细胞快速准备dna332
10.6.6方案6用培养于24孔组织培养板中的细胞准备dna333
10.6.7方案7挑取克隆前对es细胞克隆进行基因型分析334
参考文献336
第11章嵌合体的制作337
11.1总论339
11.2嵌合体的类型341
11.2.1二倍体胚胎二倍体胚胎聚集的嵌合体341
11.2.2es细胞二倍体胚胎聚集和注射的嵌合体342
11.2.3二倍体胚胎四倍体胚胎聚集的嵌合体342
11.2.4es细胞四倍体胚胎凝集和注射的嵌合体343
11.3es细胞注射嵌合体的产生344
11.3.1注射用囊胚的准备344
11.3.2注射用es细胞的准备345
11.3.3注射针和固定针的制备345
11.3.4es细胞注射针针尖的制备346
11.3.5显微注射仪的组装346
11.4聚集嵌合体的制作347
11.5嵌合囊胚的移植347
11.6用es细胞注射或聚集法所产生的嵌合小鼠的饲养347
11.7实验方案348
11.7.1方案1注射用es细胞的制备348
11.7.2方案2sutter拉针仪p97型有用参数的确定349
11.7.3方案3es细胞注射针尖的折断350
11.7.4方案4显微注射仪的组装351
11.7.5方案5囊胚注射352
11.7.6方案6制备凝集用的es细胞355
11.7.7方案7制备凝集板356
11.7.8方案8去透明带357
11.7.9方案9四倍体胚胎的产生358
11.7.10二倍体胚胎之间的聚集360
11.7.11方案11把卵裂期的胚胎和囊胚期的内细胞团细胞分散成单个细胞364
11.7.12方案12免疫外科手术分离囊胚的内细胞团365
参考文献368
第12章小鼠基因组变化及其特定序列的检测和分析371
12.1动物的标记373
12.2用于检测基因型或转基因特征的组织样品和dna制备374
12.3检测和分析原核注射产生的转基因375
12.4检测和分析es细胞介导的基因/基因组改变376
12.5小鼠染色体和核型377
12.6转基因表达分析377
12.7克隆转基因宿主dna连接379
12.8鉴别纯合转基因小鼠或胚胎379
12.8.1量化转基因剂量380
12.8.2量化转基因产物或表型380
12.8.3间期核的原位杂交380
12.8.4后代检测380
12.8.5用搭界探针进行southern印迹分析381
12.8.6用搭界引物进行pcr分析381
12.9实验方案381
12.9.1方案1从小鼠尾尖中提取高分子量dna381
12.9.2方案2从胚胎组织、卵黄囊和脐带等提取高分子量dna382
12.9.3方案3用于制备pcr模板的组织裂解383
12.9.4方案4聚合酶链式反应386
12.9.5方案5从es细胞或其他培养细胞中制备southern杂交用或pcr用 dna387
12.9.6方案6小鼠细胞核型分析388
参考文献390
第13章小鼠孤雌生殖、原核移植和克隆393
13.1孤雌胚的制作395
13.2原核移植395
13.3小鼠克隆395
13.4实验方案396
13.4.1方案1乙醇诱导的卵母细胞孤雌激活396
13.4.2方案2小鼠胚胎的原核移植396
13.4.3方案3小鼠克隆402
参考文献409
第14章辅助生殖——卵巢移植、体外受精、人工授精和胞质内精子注射411
14.1不育413
14.1.1雌性不育413
14.1.2雄性不育414
14.2挽救小鼠生殖功能的策略414
14.2.1卵巢移植414
14.2.2体外受精415
14.2.3人工授精418
14.2.4胞质内精子注射418
14.3实验方案419
14.3.1方案1卵巢移植419
14.3.2方案2体外受精420
14.3.3方案3非手术法人工授精422
14.3.4方案4手术法人工授精424
14.3.5方案5胞质内单精子注射425
参考文献432
第15章小鼠胚胎的冷冻、解冻及运输435
15.1胚胎冷冻437
15.1.1平衡冷冻法437
15.1.2非平衡冷冻法437
15.1.3胚胎冷冻中应考虑的因素438
15.2精子冷冻保存438
15.3卵巢冷冻保存439
15.4储藏和记录439
15.5小鼠品系的恢复440
15.6小鼠胚胎的运输441
15.7实验方案441
15.7.1方案1胚胎慢速冷冻法441
15.7.2方案2胚胎快速冷冻法443
15.7.3方案3精子冷冻447
15.7.4方案4卵巢冷冻449
15.7.5方案5胚胎的包装和运输450
参考文献451
第16章基因表达产物、细胞、组织及器官系统的观察技术457
16.1基因表达产物的观察459
16.1.1提取鼠胚胎或胎儿组织中的总rna459
16.1.2电泳分析嵌合组织中的磷酸葡萄糖异构酶同工酶459
16.1.3普通免疫组化和原位杂交技术用于分析鼠胚胎部分组织459
16.1.4胚胎切片免疫组化460
16.1.5全胚免疫组化460
16.1.6胚胎和组织切片的rna探针原位杂交460
16.1.7全胚的rna探针原位杂交461
16.1.8β半乳糖苷酶活性染色462
16.1.9碱性磷酸酶活性染色463
16.2细胞观察(荧光蛋白观察)463
16.3组织和器官系统的观察465
16.3.1组化染色观察小鼠骨骼465
16.3.2印度黑染色液注射观察胎儿血管系统465
16.3.3塑形术观察胎儿大血管467
16.4实验方案467
16.4.1方案1提取小鼠胚胎或胎儿组织中的总rna467
16.4.2方案2电泳分析嵌合组织中的磷酸葡萄糖异构酶同工酶469
16.4.3方案3组织固定液的准备471
16.4.4方案4处理囊胚用于固定472
16.4.5方案5石蜡包埋472
16.4.6方案6切片474
16.4.7方案7准备载玻片和盖玻片用于原位杂交475
16.4.8方案8切片去石蜡和再水化用于原位杂交或染色477
16.4.9方案9胚胎切片免疫组化477
16.4.10方案10全胚免疫组化479
16.4.11方案11胚胎和组织切片的rna探针原位杂交482
16.4.12方案12全胚rna探针原位杂交487
16.4.13方案13全胚原位杂交后胚胎成像491
16.4.14方案14全胚原位杂交后胚胎切片491
16.4.15方案15β半乳糖苷酶（lacz）活性染色493
16.4.16方案16碱性磷酸酶活性染色496
16.4.17方案17着床后全胚绿色荧光蛋白（gfp）表达的观察496
16.4.18方案18活细胞gfp融合蛋白观察497
16.4.19方案19固定细胞内gfp的观察497
16.4.20方案20固定和石蜡包埋用于gfp观察498
16.4.21方案21alcian蓝染胎儿软骨组织499
16.4.22方案22alcian蓝/茜素红（alizarine）染软骨和骨组织499
16.4.23方案23出生后胎儿骨组织的茜素红染色500
16.4.24方案24注射印度黑染液观察胎儿血管系统501
16.4.25方案25塑形术（plastic casting）观察胎儿大血管502
参考文献502
第17章显微操作实验室的建立505
17.1小鼠、饲养管理和标记系统507
17.1.1近交系、远交系、杂交系和遗传修饰小鼠507
17.1.2笼具、饲养管理和标记507
17.2显微操作实验室及其环境508
17.2.1总则508
17.2.2显微注射实验室的常用仪器508
17.2.3体视显微镜及其有关设备510
17.2.4显微操作设备512
17.2.5电融合和聚合513
17.2.6用玻璃毛细管制作显微操作工具513
17.2.7精细仪器和工具514
17.2.8耗材和塑料器皿515
17.2.9冷冻保存515
17.3信息资源515
17.4声明517
附录1缓冲液和溶液519
参考文献526
附录2注意事项527
附录3供应商536
索引537